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蛋白表达纯化

来源:河南省生物工程技术研究中心作者:李玉林日期:2020/11/20 8:55:08
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    中心拥有一流完善的研究开发设备320余台套,建有细胞、基因、蛋白质、发酵、制剂工程等5个标准化实验室和1个检测中心,拥有了30项优势技术、10个标准化操作平台,可为国内外客户提供从基因到蛋白纯化的整套技术服务。

1.蛋白表达服务

1.1重组蛋白原核表达服务(大肠杆菌系统)

利用生物信息学软件分析稀有密码子蛋白亲水性和跨膜结构域,对基因进行密码子优化和片段设计;通过多种载体组合使其尽可能的分泌表达,形成接近天然构象的重组蛋白;并通过多种规模蛋白发酵模式(500ml、1L、5L、10L)获得高纯度毫克级重组蛋白LAL检测法低内毒素<0.1EU/ug)。

1 重组蛋白原核表达服务项目

序号

类别

服务内容

1

全基因合成

包含目的基因合成与亚克隆,可选择的表达载体以pET和pGEX系列为主。服务周期:2-3周。

2

原核蛋白表达及纯化

包括E.coli表达菌株转化、筛选、表达和纯化,可选择的表达菌株:BL21 (DE3)、Rosetta-gami (DE3)、OrigamiB (DE3)、Rosetta (DE3)等。服务周期:3-4周。

2 可选标签

序号

标签

纯化条件

1

Poly-Arg

0.80kDa,阳离子交换树脂,NaCl线性洗脱(0–400 mM)

2

Poly-His

0.84kDa,Ni2+琼脂柱,20–250 mM咪唑/低pH

3

FLAG

1.01kDa,FLAG抗体亲和琼脂柱,2–5 mM EDTA

4

Strep-tag II

1.06kDa,链亲和素,2–25 mM脱硫生物素

5

c-myc

1.20kDa,myc抗体亲和琼脂柱,低pH

6

S-tag

1.75kDa,S蛋白琼脂柱,3 M异硫氰酸; 0.2 M柠檬酸钾, pH 2或3 M MgCl2

7

Fh8

8.0kDa,Ca2+依赖性苯基琼脂糖凝胶,10 mM EDTA

8

Trx

11.7kDa,4氨基氧化苯胂琼脂凝胶柱,5–1000mM 2-巯基乙醇

9

SUMO

12.0kDa,亲和标签纯化(His)

10

BRT17

14.7kDa,25–75 mM Ca2+溶液沉淀

11

GST

26.0kDa,谷胱甘肽琼脂柱,10–20 mM还原谷胱甘肽

12

HaloTag7

34.0kDa,氯烷烃配体琼脂柱,带标签挂柱蛋白酶裂解

13

MBP

42.5kDa,交联支链淀粉,10 mM麦芽糖

14

ELPs

47.0kDa,高浓度NaCl (>1.5 M)或温度转变方式

15

NusA

54.8kDa,亲和标签纯化(His)

1.2重组蛋白酵母表达服务

3 重组蛋白酵母表达服务项目

序号

类别

服务内容

1

酵母表达载体亚克隆

 

密码子优化,基因合成(或客户提供质粒模板:目的基因扩增)

将目标基因亚克隆到合适的表达质粒上,可提供表达载体,如pPICZaA 、pGAPZaA、pPIC9K

拼接序列验证:测序

交付:正确构建的重组表达质粒,含重组质粒的DH5α菌株及测序原始报告

2

酵母表达菌株转化

可提供表达菌株:X33,GS115,酿酒酵母等。

扩增培养5-10个阳性克隆并进行重组蛋白诱导表达

SDS-PAGE交付:阳性克隆菌株及表达筛选结果报告。

3

酵母表达菌株筛选

检测重组蛋白表达情况(适用于多拷贝数和高表达菌株)

交付:阳性克隆菌株及表达筛选结果报告。

4

酵母表达菌株表达优化

对挑选出来的单克隆菌株,优化培养及诱导条件(培养基,菌体密度,甲醇浓度,诱导时间等),提高目标蛋白的表达量

5

小规模蛋白表达及纯化

1L发酵液通过亲和,离子交换,疏水及凝胶过滤等多种层析方法纯化表达的重组蛋白。

SDS-PAGE交付:重组蛋白0.02-3mg及纯化报告。可按客户要求提供含纯化标签(Tag)或切除纯化标签(Tag)的最终蛋白,纯度>85%。

6

大规模蛋白表达及纯化

10L,30L,80L,130L,500L发酵规模

7

增值服务

通过HPLC,质谱等方法详细检测目标蛋白的质量。

蛋白质N端测序:PPSQ31(Edman降解法测序仪)

2.蛋白质纯化服务

   多年来致力于蛋白表达与纯化的相关研究,拥有综合性的蛋白纯化技术、多种纯化体系,能够提供多元化的蛋白纯化方案。仅GE纯化基质已有十多种,能同时大规模、扫描式的进行蛋白纯化和分离工作,节省客户宝贵的科研时间,以高质量满足客户需求。我们可提供定制的蛋白纯化服务包括,有/无标签重组蛋白,天然蛋白的纯化分离等。根据蛋白性质设计亲和纯化、离子交换、分子筛、疏水等多种蛋白纯化实验方案,获得的高纯度蛋白质,可根据客户需求一对一进行个性化方案定制,能够满足蛋白质折叠、重结晶等一系列精细实验要求。

4 常规纯化项目

序号

类别

服务内容

1

 凝胶过滤层析

根据分子间的大小或者形状差异进行分离,特别适用于分离相对分子质量大于2000的高分子化合物和相对分子质量差异大的混合物及低聚物。

2

离子交换层析

根据蛋白质分子表面静电荷的差异进行分离,阳离子交换主要是改变pH,主要应用于等电点大于5的蛋白质;阴离子交换主要是改变盐浓度,适用于大部分蛋白质,除杂能力较强,对热源质、核酸、外毒素及电荷性有差别的蛋白效果显著。

3

疏水层析

根据蛋白质与疏水吸附剂之间的疏水作用差异进行分离,适用范围广,原则上可用于所有蛋白质的纯化,适合于从大体积中提取低含量的目标蛋白,对DNA及小牛血清去除率较高。

4

亲和层析

根据生物活性物质与特异性配体间的特异性亲和力来达到分离目的,适用于抗原抗体亲和纯化,以及一系列标签纯化。

5 亲和纯化项目

序号

类别

服务内容

1

HIS Tag

一般为6-8个组氨酸组合,标签小,纯化简单;能与其他标签形成双标签;能纯化可溶性/包涵体蛋白。组氨酸残基上的咪唑基团可与层析介质中的金属离子螯合,再通过提高缓冲液中咪唑浓度进行竞争性洗脱达到纯化效果。

2

GST Tag

26KD,可溶性标签,提高蛋白表达的可溶性;不能应用于包涵体等需变形处理的纯化;利用GST融合蛋白与固定的谷胱甘肽(GSH)通过硫键共价亲和,通过GSH交换洗脱原理来进行纯化。

3

Flag Tag

8个氨基酸DYKDDDDK,在真核表达系统中表达效率更高;

可以纯化有活性的融合蛋白,琼脂糖上偶联有flag抗体,可采用竞争性洗脱或酸性洗脱。

4

MBP Tag

42.5 KD,多糖树脂吸附,可以减少目标蛋白的降解,增加蛋白的表达量和稳定性,提高表达产物的水溶性,但标签较大,对蛋白的结构和功能会有一定影响。适用于包涵体的纯化。

5

Strep Tag

8个氨基酸WSHPQFEK,生物素(biotin)和抗生物素蛋白链菌素(streptavidin)之间的结合反应。纯化流程温和能保持目标蛋白活性;能进行变性条件下的纯化;价格相对HIS Tag而言较高。

6 天然蛋白纯化服务项目

序号

类别

服务内容

1

天然大分子蛋白分离纯化

选用适当孔径的分子筛分离纯化,配合使用阴、阳离子吸附柱以及HLPC,鉴定并收取相应洗脱峰。

2

天然小分子蛋白分离纯化

多层级分离过滤配合分子筛去除大分子杂质,结合使用大孔树脂或反向树脂纯化小分子蛋白,经 HPLC和MS鉴定纯化。

3

混合未知蛋白样品分离纯化

由卡梅德生物制定相应方案进行分离纯化,并经质谱鉴定、活性鉴定等多种方案确认分离产物。                     

 7 重组蛋白纯化服务项目

序号

类别

服务内容

1

重组蛋白脱标签及分离纯化

商品化亲和纯化树脂,如Ni柱,GST-Beads等分离纯化带有6xHis、GST、SUMO、MBP融合蛋白,获得纯度90%以上融合蛋白

2

不含标签的重组蛋白纯化

抗体亲和纯化;也可选择类似于天然蛋白纯化方式,依项目而定

3

包涵体变性与复性纯化

根据蛋白质不同的性质,可以选择尿素、盐酸胍、去垢剂、极端pH等,以保证最大程度获得单体状态的变性蛋白

 

3.特色表达服务

中心可根据客户提供目的基因或基因序列,交付质粒DNA、表达菌株、纯度90%以上的重组蛋白质和表达产物检测报告。检测报告主要包括测序报告、实验条件、SDS-PAGE报告和COA等。

3.1基因合成及密码子优化(可选)基因序列通过密码子优化后,蛋白表达量可提高几倍至数十倍。

3.2载体构建包括IPTG,阿拉伯糖,热休克,冷休克诱导方式,GST,Trx,SUMO,BMP,His,HA,Flag,myc等融合标签载体的构建。提供客户正确构建的重组表达质粒。

3.3表达菌株筛选将表达质粒转化到高效的E. coli表达菌株中。SDS-PAGE电泳检测,挑选合适的单克隆菌株用于目标蛋白的表达。可提供表达菌株:DH5α, Top10,  BL21 (DE3), BL21 (DE3) pLys, Golden, Rosetta(DE3), RosettaBlue(DE3),Rosetta gami B (DE3), C41等宿主。提供客户含重组质粒的表达菌株。

3.4蛋白表达及纯化诱导表达目标蛋白。通过亲和层析,离子交换,疏水及凝胶过滤等多种层析方法纯化目的蛋白;可根据需求切除标签,再纯化获得目标蛋白。提供客户纯化后的目标蛋白,可按客户要求提供含纯化标签(Tag)或切除纯化标签(Tag)的最终蛋白,纯度根据客户要求可达95%以上甚至更高。

3.5包涵体复性蛋白诱导表达与包涵体纯化,数百种缓冲条件快速筛选最佳复性缓冲,采用稀释复性,透析复性,柱层析复性等多种技术获得纯度大于90%的包涵体。

3.6蛋白大规模制备如果想要纯化获得克级蛋白,需要使用发酵罐发酵获得上百克到公斤级的菌体,中心提供成熟的发酵罐发酵平台进行大肠杆菌或者酵母菌的高密度发酵。其中,5L 小罐发酵(2.5L工作体积),周期2周 50L 大罐发酵(25L 工作体积),一般可收获1Kg左右菌体,周期2周

 


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