自产品 RT-PCR一步法试剂盒(混合酶法)

2017-08-18 09:35:44 作者:曹继宗 来源: 浏览次数:0 网友评论 0

 RT-PCR一步法试剂盒(混合酶法)

RT-PCR One Step Kit(Enzyme Mix)


目 录 号:20071001
规 格: 50人份/Kit
储存条件: —20℃
有 效 期: 2年

产 品 简 介

  RT-PCR是将反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的片断。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基因表达水平,细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。

  一步法即反转录和PCR扩增在同一管内完成,cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖,有助于减少污染。而且由于得到的所有cDNA样品都用来扩增,所以灵敏度更高,最低可以达到0.01pg总RNA。一步法RT-PCR一般使用基因特性性引物起始cDNA合成。

  本试剂盒采用的酶混合物含Mu-MLV、Taq DNA聚合酶及核糖核酸酶抑制剂,可有效防止RNA的降解。通过试剂优化,在有非特异RNA的存在下,反转录酶的活性不受抑制。采用一步法对总RNA进行高灵敏度及特异性的反转录及PCR扩增。最大的扩增片段可达2kb.

产 品 组 成

100ul RT-PCR酶混合物

150ul 10×反应缓冲液(无Mg2+)

200ul MgSO4(25mM)

120ul dNTPs(A、G、C、T) 2.5mM

1支 液体石蜡

操 作 过 程

操作之前,您需要准备好以下成分:

RNA模板

上游引物

下游引物

无菌双蒸水

加样之前,需将各组分稍微混匀及离心。

每管加入:

RT-PCR酶混合物 2.0ul

10×buffer(无Mg2+) 3.0ul

MgSO4(25mM) xul

dNTP(2.5mM) 1.2ul

上游引物 xul

下游引物 xul

RNA模板 xul

无菌双蒸水 至30ul

铺上液体石蜡 30ul

稍微混匀离心后,37℃反转录30-60分钟,得到的cDNA即可进行PCR扩增。

注 意 事 项

1. 建议使用试剂盒提供的Buffer.

2. 镁离子浓度对反应结果影响很大。可从1mM到3mM,间隔0.5mM进行一系列反应,确定对于每个模板和引物的最佳镁离子浓度。建议Mg2+使用终浓度为1.5mM。注意:对实时定量PCR,使用3mM到5mM的镁离子浓度。

3. 设计引物时,避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。另外,设计时应考虑设计Tm值相近的引物。

4. 使用适量模板RNA,模板量太多会降低特异性,太少会导致扩增不出条带或条带太弱。

5. 使用热盖式PCR仪,可以不加液体石蜡。


河南省生物工程技术中心 研制

郑州博为生物工程有限公司 生产

订货电话:0371-63557566 技术支持:0371-67999699

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